核酸适配体(核酸适配体(Aptamer)VS 抗体(Antibody),人工与自然的又一次抉择)

核酸适配体

核酸适配体 (Aptamer) 是一种经体外筛选技术-指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),得到的结构化的寡核苷酸序列 (RNA或 DNA),与相应的靶标分子(蛋白质,病毒,细菌,细胞,重金属离子等)有严格的识别能力和高度的亲和力。
所以对于靶标分子来说,核苷酸来源的核酸适配体和多肽来源的抗体,一个是人工体外筛选的,一个是来自于天然免疫产生的,人工与天然,究竟殊途同归还是背道而驰?
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首先我们来了解下分子内或分子之间的相互作用力,包括共价键,氢键,范德华力,疏水作用和静电引力。
从上图来看,共价键最稳定,静电引力其次,然后是氢键,然后是疏水作用,最弱的是范德华力。
经总结,分子之间的相互作用力归纳如下:
DNA与DNA:主要是氢键
DNA与蛋白:主要是静电引力,氢键,范德华力
蛋白与蛋白:主要是疏水作用力,静电引力,范德华力,氢键
下面将举例说明DNA和蛋白之间与蛋白与蛋白之间的相互作用力是否有所不同。 
01DNA和蛋白的相互作用力
我们会通过核小体去阐述自然界早已存在的两者的相互关系:
核小体有DNA和组蛋白缠绕组成,而这种缠绕包装形式都是基于DNA和组蛋白之间的相互作用力。
在氨基酸中,精氨酸、组氨酸、和赖氨酸都是极性带正电氨基酸。
组蛋白有的人会顾名思义,含有很多组氨酸,但是我们后来一查,却并没有,相反比较多的是赖氨酸和精氨酸。组蛋白构成:赖氨酸含量特别丰富的组蛋白(H1);赖氨酸含量较丰富的组蛋白(H2A和H2B);精氨酸含量丰富的组蛋白(H3和H4)。我们后来去查了下组蛋白的起名,源自“Histones and Other Nuclear Proteins By Harris Brusch”,其实只是意为“组织成分的可分解蛋白”,跟组氨酸无关。
既然组蛋白富含带正电的赖氨酸和精氨酸,而DNA的磷酸骨架是极性带负电的,所以两者可以会在静电引力的作用下产生相互作用,下图就是组蛋白中H1和DNA进行组装的过程,以及H3,H4中与DNA结合的精氨酸binding sites。
引自Bioscience Reports DOI: 10.1042/BSR20150087:
除此之外,人体内还有许多DNA和蛋白质的相互作用力,这些天然存在的两者之间的特异性的识别和亲和性,其中的重要原因是分子生物学的中心法则,“DNA → RNA →蛋白质”。体现在如下的自然事件:
核酸内切酶对核酸序列的特异性识别,
RNA聚合酶对启动子序列的特异性识别,
核糖体小亚基和mRNA的结合,
核糖体大亚基和tRNA的结合。
死海盐盒菌(Haloarcula marismortui)的50S亚基的三维分子结构图。分子中的淡蓝色部分为蛋白质,淡橙色及黄色部分为RNA单链。分子核心的亮绿色部分为亚基的活性中心。从此图看出,核酸和蛋白的结合可以非常紧密和牢固。
02蛋白与蛋白相互作用力
下图右侧的第二幅图:抗原抗体复合物由HIV-1 gp120 V3区域的抗体Fab和V3(JR-FL)抗原组成. (A) 抗原结合位点的立体展示. (B) 抗原抗体相互作用示意图. 虚线表示氢键,眼线表示范德华力。引自J. Virol. September 2013 vol. 87 no. 18 10221-10231。

然后结合左侧蛋白之间相互作用力的示意图,我们可以看出,抗原抗体之间以范德华力与氢键为主,然后也有静电引力。
因为范德华力与氢键和静电引力相比,属于弱作用力,所以理论上来讲,极性带负电的DNA分子与蛋白结合时可以提供更多的氧原子,提供更多的电子对去产生更多的氢键,增加相互作用的键能,维持更稳定的结构,这也是核酸适配体具有很大潜力的原因所在。
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我们再来了解下核酸适配体的优缺点:
03核酸适配体的筛选过程-SELEX
首先是用组合化学合成DNA的方法合成随机序列的核酸库,库中的每一个成员是一个线形的寡聚物,库中分子多样性的程度取决于随机寡核苷酸的长度。理论上讲,一个40个碱基的随机序列可有1.2 X 1024种核苷酸排列顺序(440 =1.2 X 1024)。实际上,能否找出与靶分子相互作用的特异序列,很大程度上取决于组合库的多样性。筛选过程一般包括几轮筛选,每轮筛选包括3个主要步骤:
(1)寡核苷酸随机序列库和靶标分子孵育;
(2)寡核苷酸/靶标分子复合物和未结合的寡核苷酸分离;
(3)洗脱结合的寡核苷酸序列,采取PCR扩增这些序列库,再进入下轮的筛选过程。
通过重复上述的筛选与扩增循环,那些与靶标分子亲和力较低的序列被洗脱掉,而与靶标分子有强亲和力的Aptamer序列被富集,最后占据序列库的大多数 (>90%)。一般经过6-15轮的循环就可以获得特异性的Aptamer。
04Aptamer和Antibody的对比
下面是一张Base Pair Biotechnologies总结的Aptamer和Antibody的对比,并总结了Aptamer的优点,总的来说就是: 筛选周期短;适合于毒素和低免疫原性抗原;工作浓度低;批次差异性小;放大工艺简单;低成本;稳定易保存;常温运输。
引自Prog Pharm Sci Aug. 2016 Vol. 40 No. 8
05Aptamer的商业化之路
但是迄今为止,Aptamer的商业化应用还未真正广泛开展起来,也因为其也有不少有待改进的地方。包括:
第一SELEX过程在人为环境中完成,这些人为环境与生理环境不同,因此得到的aptamer的亲和性没有抗体高。
第二是专利问题限制了Aptamer的大规模商业化开发。1992年,Larry Gold发明了SELEX方法,所以其专利布局大多在2000年前后,现在的Aptamer专利受益人还有两家-Gilead Sciences(1999年与Larry创立的Nexstar Pharmaceuticals合并)和Larry创立的SomaLogic Inc(主攻蛋白组学),所以鉴于这两家都自己不进行Aptamer研发,收取高额专利授权费用(2001年授权给Archemix收费1750万美元),而SELEX有点类似于新药开发一样,从大规模化合物库里筛选最有效的小分子化合物,这是一个资金量大的研发项目,如果没有商业价值,一般企业都会望而却步。
第三是结合位点研究缺乏问题,很多aptamer筛选出来,如果分析出序列中的binding sites,对于后续aptamer的筛选都是很好的研究基础。如果进行后续的修饰,活性会更好,所以binding sites的研究也需要像蛋白一样进行三维结构的解析,从立体空间上分析结构域的稳定和特异性结合。
所以受限于专利和经费的aptamer研究至今为止产生了为数不多的可用的aptamer,但是Larry的专利大多会在2020年左右失效,估计对于这细分产业界还是个好消息。
至2017年,只有Nexstar当初转给EyeTech Pharmaceuticals的Macugen于2014年获批,其他为数不多的产品都在II期或者III期。Archemix的ARC系列有三个,ARC1905, ARC1779, ARC19499。

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从分子之间相互作用力来看,以静电引力和氢键为主的核酸适配体与蛋白之间的作用力甚至可以超过以范德华力和氢键为主的抗原抗体之间的作用力,同时核酸分子和蛋白之间的相互作用已经在核小体组装等体内应用里表现出非常紧密和牢固的结合,所以人工筛选结合力强的核酸适配体前景还是非常好的。
随着SELEX技术的日趋完善、成熟,其广泛应用道路上的诸多挑战最终会被一一逐步克服。Aptamer因价格低廉,易于合成,常温保存等诸多优势,在未来的很长一段时间会对抗体在药物治疗和体外诊断中的地位构成挑战,而且随着2020年后各大aptamer专利的过期,商业化浪潮最终将会到来。
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